Απομόνωση Bacillus thuringiensis (Bt) από δείγμα εδάφους

Απομόνωση Bacillus thuringiensis (Bt) από δείγμα εδάφους

September 30, 2022 0 Von admin
  • Bacillus thuringiensis Το (Bt) είναι ένα πανταχού παρόν, θετικό κατά Gram και σποριώδες βακτήριο που συνθέτει εντομοκτόνες πρωτεΐνες με ειδικότητα ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα εντόμων κατά τη διάρκεια της σπορίωσης (Cry και Cyt) και της βλαστικής ανάπτυξης (Vip και Sip).
  • Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν απεικονίσει το Bt ως μια φιλική προς το περιβάλλον εναλλακτική λύση στα χημικά εντομοκτόνα.

Απομόνωση Bacillus thuringiensis (Bt) από δείγμα εδάφους

Αρχή της απομόνωσης του Bacillus thuringiensis

Οι ευρέως χρησιμοποιούμενες μεθοδολογίες για την απομόνωση του Bt από το έδαφος συνίστανται σε επεξεργασία θερμικού σοκ που ακολουθείται από επιλεκτική βλάστηση σπορίων. Το θερμικό σοκ χρησιμοποιείται για την εξάλειψη όλων των βακτηρίων που δεν είναι ικανά να παράγουν ενδοσπόρια από το έδαφος του δείγματος. Τα δείγματα στη συνέχεια αραιώνονται πολλές πτυχές για να εξαλειφθεί η ποσότητα του χουμικού υλικού μέσα στο έδαφος και να μειωθούν οι συνολικές μονάδες σχηματισμού αποικιών μέσα στο δείγμα. Τα αραιωμένα δείγματα στη συνέχεια καλλιεργούνται σε θρεπτικό άγαρ προκειμένου να δοθεί η ευκαιρία στα σπόρια να βλαστήσουν σε μέσα με επαρκή θρεπτικά συστατικά και στη βέλτιστη θερμοκρασία. Τα μέσα προσφέρουν ευνοϊκές συνθήκες ανάπτυξης για ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων συμπεριλαμβανομένων Bacillus thuringiensis. Μια σειρά από δοκιμές επιλογής χρησιμοποιούνται έτσι περαιτέρω για την ταυτοποίηση Bacillus thuringiensis μόνο από το φάσμα των βακτηρίων που υπάρχουν στον πληθυσμό του ακατέργαστου δείγματος εδάφους. Συνήθεις σημαντικές δοκιμές περιλαμβάνουν δοκιμή επιλογής οξικού νατρίου, χρώση Gram, χρώση Amino black and Ziehl’s carbol fuchsin, χρώση με ενδοσπόρια, δοκιμή καταλάσης, έλεγχος για ανάπτυξη άνω των 45οΓ και αναζητούν παρουσία παρασπορικών φορέων μεταξύ άλλων.

Διαδικασία απομόνωσης του Bacillus thuringiensis

  1. Λάβετε περίπου 20 g δείγματος καλλιεργημένου ή μη εδάφους με σωληνοειδές δειγματολήπτη εδάφους αφού αφαιρέσετε τα 2-3 cm του ανώτερου στρώματος.
  2. Τοποθετήστε τα δείγματα στους 4 ºC σε φυγοκεντρικούς σωλήνες των 50 ml ή σε σάκους με φερμουάρ μέχρι να απομονωθούν.
  3. Εναιωρήστε τα δείγματα εδάφους του 1 g σε 10 ml 0,85% NaCl.
  4. Ζεσταίνουμε με ανακίνηση στους 70°C για 10 λεπτά.
  5. Δείγματα πλάκας 100 μl εναιωρήματος σε θρεπτικό άγαρ (0,5% πεπτόνη, 0,3% εκχύλισμα βοείου κρέατος, 0,5% NaCl και 1,5% άγαρ).
  6. Επωάστε τα τρυβλία στους 30±2°C για 48 ώρες.
  7. Υποκαλλιεργήστε βακτηριακές αποικίες που εμφανίζουν φαινότυπο τύπου Bt για απομόνωση μιας αποικίας ξανά σε φρέσκα τρυβλία και επωάστε.
  8. Χρωματίστε την καλλιέργεια με amino black και Ziehl’s carbol fuchsin και εξετάστε υπό ένα τυπικό μικροσκόπιο φωτός για προκαταρκτική ταυτοποίηση.

Αναμενόμενα Αποτελέσματα Απομόνωσης του Bacillus thuringiensis

  • Οι αποικίες εμφανίζονται ως επί το πλείστον σε λευκό ματ χρώμα, επίπεδες, ξηρές και με ανομοιόμορφα όρια.
  • Καλλιέργειες που δείχνουν παρασπορικούς κρυστάλλους βαμμένους μαύρους σε μικροσκοπική παρατήρηση μπορεί να είναι σημαντικές και να απαιτούν αποθήκευση.

Αναφορά

  1. (PDF) Απομόνωση και χαρακτηρισμός του Bacillus thuringiensis που απομονώνεται από το έδαφος και η πιθανή επίδρασή τους στις προνύμφες Culex pipiens. Διαθέσιμο από: https://www.researchgate.net/publication/299845038_Isolation_and_Characterization_of_Bacillus_thuringiensis_Isolated_from_Soil_and_their_Possible_Impact_on_Culex_pipiens_Larvae [accessed Nov 04 2018].
  2. Travers, RS, Martin, PA and Reicheferfer, CF 1987. Επιλεκτική διεργασία για αποτελεσματική απομόνωση εδάφους Bacillus spp. Εφαρμοσμένη και Περιβαλλοντική Μικροβιολογία. 53, 1263-1266.
  3. http://biopublisher.ca/index.php/bt/article/html/2019/
  4. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167701208002352
  5. https://aem.asm.org/content/aem/53/6/1263.full.pdf
  6. https://core.ac.uk/download/pdf/39664802.pdf